X
تبلیغات
رایتل

گروهی از آنزیم های محدود الاثر هنگام برش ، توالیهای مورد شناساییشان را بطور نامتقارن میشکنند، در نتیجه در انتهای قطعات DNA حاصله رشتههای تکی با حدود ۴ نوکلئوتید بوجود میآید که به این انتهای تک رشتهای ، انتهای چسبنده (Sticky end) میگویند. یکی از آنزیمها ECORI نام دارد که باعث ایجاد قطعاتی میشود که در انتهای خود ، چسبنده میباشند.

حال فرض کنید که دو قطعه متفاوت DNA به وسیله یک آنزیم محدودالاثر یکسانی برش داده شدهاند، اگر قطعات حاصل از این برش با هم مخلوط شوند. و شرایط مناسب فراهم شود. انتهاهای چسبناک که مکمل هم میباشند به هم متصل میشوند. سپس بوسیله آنزیم "DNA لیگاز" این رشتهها به صورت کووالانسی به هم متصل میشوند.

هدف اصلی برش DNA در مهندسی ژنتیک ، اتصال دو قطعه DNA به یکدیگر میباشد. ولی هنگام اتصال قطعات DNA ممکن است به جای اینکه قطعات DNA به هم متصل شوند، دو سر یک مولکول DNA بار دیگر به هم بچسبند و در نتیجه نوترکیب صورت نگیرد. برای جلوگیری از این کار از آنزیم فسفاتاز قلیایی استفاده میکنند. به این صورت که پس از برش دادن حامل بوسیله آنزیم محدودالاثر. فسفاتاز را به محیط واکنش میافزایند و در نتیجه فسفات انتهای ۵ مولکول DNA در هر دو طرف جدا میشود و امکان اتصال دو سر مولکول حامل ، بدون DNA تازه ، به یکدیگر از بین میرود.

سیستمهای کلون کردن ژن

کلون کردن یک ژن خاص مهمترین مرحله مهندسی ژنتیک است. هدف از کلون کردن ژن به دست آوردن مقادیر زیادی از ژنهای خاص به صورت خالص میباشد. هدف اصلی کلون کردن ژن ، انتقال ژن مورد نظر از داخل یک ژنوم بزرگ و پیچیده به داخل یک حامل ساده و کوچک تکثیر آن است. کلون کردن ژن را میتوان به مراحل زیر تقسیم کرد:

جداسازی و قطعه قطعه کردن منبع DNA: منبع DNA میتواند، ژنوم کامل یک موجود باشد که در این صورت، باید آن را بوسیله آنزیم محدودالاثر برش داد و قطعات حاصله را برای کلون کردن بکار برد.

اتصال به یک حامل کلون (Cloning Vector): حاملهای کلون ، قطعات ژنتیکی کوچکی هستند که به طور مستقل توانایی تکثیر دارند و دارای محل برش بوسیله آنزیمهای محدودالاثر میباشند، ولی این برش نباید در محل همانند سازی این حاملها باشد.

ورود به داخل میزبان: DNA نوترکیب حاصل به روشهای مختلف وارد باکتری یا میزبان مورد نظر میشود.

شناسایی و جداسازی کلون حاوی ژن مورد نظر: این مرحله شامل جداسازی میزبانهایی است که ژن مورد نظر بوسیله حامل وارد آنها شده و به نحو موثر بیان میشود.

تولید تعداد زیاد سلولها و یا باکتریهای حاوی ژن: این کار به منظور جداسازی و بررسی ژن مورد نظر ، انجام میگیرد.

حاملهای کلون (Cloning Vector)

معمولترین حاملها در مهندسی ژنتیک ، پلاسمیدها ، ویروسها و یا قطعات حاصل از پلاسمیدها و ویروسها هستند.

پلاسمیدها

قطعات DNA حلقوی هستند. که در داخل سیتوپلاسم باکتریها و جدا از کروموزوم آنها قرار دارند و بطور مستقل تکثیر میشوند. پلاسمیدها ، خصوصیات مفیدی برای استفاده به عنوان حامل دارند مانند: اندازه کوچک ، DNA حلقوی ، همانند سازی مستقل ، تکثیر زیاد و شاخصهای مفید دیگر مانند دارا بودن ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک که جداسازی کلنی های حاوی پلاسمید را راحتتر میکند.

باکتریوفاژها

مزیتهای ویروسها را به عنوان حاصل ، میتوان در موارد زیر خلاصه کرد:

ویروسها به خاطر داشتن پروتئینهای خاص ، نفوذ بسیار موثر و اختصاصی را به داخل سلولهای میزبان انجام میدهند.

بعضی ویروسها در قسمتی از چرخه تکثیر خود ، نفوذ پایداری به داخل ژنوم میزبان دارند که این باعث پایداری بیان ژن در داخل سلول میزبان میشود. ویروسها دارای پروموتورهای خاصی هستند که بوسیله سلولهای میزبانی شناخته میشوند و این باعث بیان مناسب ژنهای کلون شده میشود.

کازمیدها (Cosmids)

کازمیدها در حقیقت قطعات حاصل از دو انتهای ژنوم از دو انتهای ژنوم باکتریوفاژها &#۶۴۳۰۶; قرار بگیرند و در نتیجه وارد سلول Ecoli شوند.

در داخل سلول E.Coli این DNA به صورت حلقوی در آمده و مانند یک پلاسمید عمل می کند.

فاسمیدها

یکی دیگر از حاملهای DNA نوترکیب هستند که ترکیبی از ژنوم باکتریوفاژ و پلاسمیدها هستند.

انتخاب میزبان مناسب

میزبان مورد نظر باید خصوصیاتی از قبیل پایداری ژنتیکی ، ژنوم کاملا شناخته شده مشخصات فیزیولوژیک معلوم ، توانایی پذیرش DNA خارجی ، داشتن یک شاخص خاص برای شناسایی در مواقع لزوم و ... را داشته باشد. یکی از شناخته شده ترین میزبانهای مورد استفاده باکتری E.Coli است. هنگام انجام کارهای ژنتیکی باید با مطالعاتی کافی یک سیستم حامل میزبان مناسب را انتخاب کرد و بکار برد. با سیلوس سوتبلییس (B.Subtilis) در مواردی که هدف از کلون کردن تولید یک پروتئین خالص میباشد، بر E.Coli ترجیح دارد. زیرا خصوصیات تخمیری این باکتری برای تولیدات صنعتی مناسب تر است.

روشهای وارد کردن حاملها به داخل میزبان

ویروسها و باکتریوفاژها

برای ویروسها و باکتریوفاژها و همچنین DNA نوترکیب که در داخل کپسید ویروس ها قرار گرفته اند (کاسمیدها) روش ورود واضح است و همانند ورود معمولی ویروس ها در سلول های میزبان است.

ترانسفورماسیون: برای این کار DNA نوترکیب را با باکتری مجاور میکنند. این روش یکی از متداولترین روشهای انتقال است.

الکتروپوریشن: در این روش قطعات DNA را در یک محیط دارای بار الکتریکی در مجاورت سلولها قرار میدهند. بار الکتریکی باعث ایجاد منافذ ریز در غشای سیتوپلاسمی میشود که این خود باعث تسهیل ورود قطعات DNA به داخل سلول میگردد.

تفنگ ذرهای یا تفنگ اسید نوکلئیک: در این روش دقیقا تنگی در مقیاس میکروسکوپی وجود دارد که گلوله آن قطعات DNA میباشد و DNA را به داخل سلول ، شلیک میکند.

انتخاب کلونها تغییر یافته

پس از اینکه DNA نوترکیب ساخته شد و در داخل باکتری میزبان ، انتقال داده شد. حال نوبت به انتخاب کلونهای باکتریایی میرسد که DNA نوترکیب مورد نظر به داخل آن انتقال یافته و به نحو موثری در داخل آن بیان شود. ۳ خصوصیت در بین حاملین مشترک است:

قدرت تکثیر در میزبان ، محل ورود ژن خارجی و یک شاخص انتخابی.

شاخصهای انتخابی موجود بر روی حاملها را میتوان به چند گروه تقسیم کرد:

مقاومت به آنتی بیوتیکها

مقاومت به آنتی بیوتیکها معمولا یا بوسیله آنزیم هایی ایجاد میشود که باعث غیر فعال شدن آنتی بیوتیکها میشوند و یا با سنتز پروتئینهایی است که به روشهای مختلف باعث ممانعت از اثر آنتی بیوتیکها میشوند. هر دو نوع مکانیزم مقاومت فوق بوسیله قطعات ژنتیکی ، کنترل میشوند. این قطعات ژنتیکی را میتوان در حاملها وارد کرد و از آنها به عنوان شاخصهای انتقال موثر استفاده کرد.

نیازهای متابولیزمی

نیازهای متابولیزمی طیف وسیعی از مواد مختلف را شامل میشود. برای این کار از گونههای خاص از میزبان استفاده میشود که تونایی ساختن یک ماده متابولیزمی ضروری از دست دادهاند، در نتیجه این باکتریها بر روی محیطهای بدون این ماده متابولیزمی رشد ، نخواهد کرد. برای مثال اگر یک باکتری توانایی تولید اسید آمینه لوسین را نداشته باشد. بر روی محیط فاقد لوسین رشد نخواهد کرد. حال اگر ما از حاملی استفاده کنیم که حاو ژن سنتز لوسین باشد، باکتریهای میزبان حاوی این حامل ها بر روی محیط فاقد لوسین رشد خواهند کرد.

پس از اینکه کلنیهای حاوی ژن نوترکیب انتخاب و جدا شدند، این کلنیها را به میزان دلخواه تکثیر میدهند و سپس ژن تکثیر شده را برای بررسیهای بعدی استخراج کرده قرار میدهند.

حاملهای بیان ژن (Expression Vector)

یک حامل بیان ژن حاصل است که نه تنها میتوان از آن به عنوان حامل کلون استفاده کرد. بلکه این حامل دارای کی توالی تنظیمی میباشد که باعث میشود که بیان ژن مورد نظر تحت کنترل مهندسی ژنتیک قرار گیرد. یک حامل بیان ژن خوب باید دارای مشخصات زیرا باشد:

تعداد کپی های ژن در هر سلول: هر چه قدر تعداد نسخههای یک ژن بیشتر باشد، میزان بیان آنها بیشتر خواهد بود. پلاسمیدها از این نظر مناسب هستند.  

با تشکر از خانم فهیمی جهت ارائه مطلب